מאז שהוקם המשרד הוא פועל נמרצות במישור האכיפה הפלילית. במשרד פועלת מערכת אכיפה מקצועית, מאורגנת ואפקטיבית.
לפעילות זו שותפים גורמים רבים, הכוללים בין היתר, גורמי פיקוח, גופי חקירה וגורמים מקצועיים במחוזות ובמטה הראשי. כמו כן, פועלים עורכי-דין בלשכה משפטית המעניקים ייעוץ משפטי שוטף לגופי האכיפה, מטפלים בתיקי החקירה ומלווים את התיקים המשפטיים, ותובעים חיצוניים בעלי הסמכה של היועץ המשפטי לממשלה אשר מנסחים את כתבי הטענות ומייצגים את המשרד בבתי המשפט השונים.

במסגרת האכיפה הפלילית של המשרד, נפתחו מאות תיקי חקירה בגין עבירות על דיני איכות הסביבה בכלל ועבירות של גרימת זיהום מקורות מים בניגוד להוראות סימן א'1 לחוק בפרט. כתבי האישום הוגשו ועודם מוגשים כנגד עבריינים שונים ובכללם רשויות מקומיות, תאגידי מים וביוב, גורמים מתחום החקלאות וגידול בעלי חיים, מפעלי תעשייה, חברות הדלק ומנהלי תחנות דלק (בגין זיהום מקורות מים מדלקים), מוסכים, מסעדות ואולמי אירועים, ולמעשה כל יצרן שפכים סניטריים ו/או תעשייתיים העובר עבירה על חוק המים ותקנותיו.

כתבי האישום שהוגשו בנושא מניעת זיהום מים בכלל ובנושא מניעת זיהום מים משפכי תעשייה ודלקים בפרט, הביאו לשינויים משמעותיים בתחום זה, הניכרים בין היתר, בהקמת מתקני טיפול בשפכים (מט"שים) והפסקת הזרמות שפכים למקורות מים.